光遗传学的最新进展晋升了在目田移动的哺乳动物中对特定电路元件进行光学限定的精度;罕见是，重组酶依赖性视卵白病毒与络续增长的抒发重组酶的转基因小鼠通盘使用，允许对特定细胞类型进行操作。关联词，尽管光遗传学限定允许以越来越纷乱的样式把握神经回路，但在目田移动的小鼠中，将光遗传学刺激与安详单元的同步多通谈电生理读数相王人集仍然是一个挑战。咱们瞎想并考据了 optetrode，这是一种允许在目田移动的小鼠中进行共定位多 tetrode 电生理纪录和光学刺激的装配。Optetrode 制造遴荐独到的以光纤为中心的同轴瞎想方法，可出产出分量轻 （2 g）、紧凑且坚固的开拓，适用于行动深重的小鼠。这种低资本开拓易于构建（无需专用开拓即可构建 2.5 小时）。咱们发现驱动瞎想产生了巩固的高质料灌音，并在植入后至少 6 周内抓续保抓这种景色。咱们通过量化内侧前额叶皮层细胞对局部光学激勉和扼制的反应来考据 optetrode，在旷场探索期间探伤小鼠中多种不同遗传界说的细胞类别。
一、关联数据
作为动物受试者1（animal subject），小鼠为筹商从学习到应答阐发2,3 的行动提供了一个相配各类化的遗传平台，包括光遗传学4-8。罕见是，病毒抒发靶向（使用启动子或 Cre 驱动细胞系 9-12 与 Cre 依赖性病毒13-15 的组合）简略对小鼠行动进行高精度的光遗传学筹商。关联词，在目田移动的小鼠中，在光遗传学操作期间同期纪录多个电行径通谈的才能有限，因此遮盖了对神经回路影响的苟且瓦解。筹商东谈主员在体外（脑切片和细胞培养）和体内麻醉 16 中平凡遴荐电生理学来测量光刺激对神经放电的影响。关联词，切片和麻醉的大脑与当然澄澈景色的大脑较着不同17。因此，理思情况下，在目田移动的行动历程中必须不雅察和扰动神经行径，以将特定神经景色与行动景色关联联并因果关系化。
张开剩余95%尽管高通量清夺目田移动电生理学的方法关于大型动物（举例大鼠18-25）很容易赢得，但由于小鼠不错佩戴的植入物的大小和分量有限，将多个安详单元的电生理纪录与清夺目田移动小鼠的光学硬件相王人集仍然是一个挑战26。最近，很多草创性的奋发推动了小鼠澄澈电生理学开拓的开发，尽管其中很多植入物与光遗传学方法27,28 不相容，或者由于植入物的尺寸和分量，需要在纪录期间固定小鼠29 头部。咱们瞎想、考据并使用了 optetrode，一种袖珍驱动器 optrode，特殊针对将目田移动的小鼠电生理学与光遗传学限定相王人集的罢休和挑战量身定制。
二、后果
2.1 Optetrode 瞎想和考据
鉴于光遗传学实验从压根上依赖于向大脑的光传输，咱们从开拓中心的光纤来源（图 1a）。关于电生理纪录，该开拓配备了 16 根微线（团聚物涂层镍铬合金，直径 12 μm），缠绕成四个19,20（直径，~25 μm）的四极不断，以促进从光传输区域中的单个神经元拒绝信号。为了确保纪录站点隔邻一致且实足的光强度，咱们将四极不断刚性连续到光纤轴（直径，~200 μm）并切割它们以超出光纤结尾 300-1,000 μm。高纤维直径与四极管直径之比 （200：25） 确保四极不断对后光的暗影不错忽略不计。因此，纤维在通过脑组织的翻译历程中既充任光源，又充任四极管的结构因循。由此产生的光纤四极管组件与定制的同轴机械驱动器相王人集，从而允许在植入后把握纪录位点。驱动器瞎想由一个透风螺钉、一个拇指螺母和一个塑料外壳构成。纤维四极管组件齐心穿过透风螺钉，透风螺钉的加工使塑料外壳谢却其旋转（图 1b）。因此，拇指螺母的旋转将螺钉和纤维四极管组件同轴平移（不旋转）穿过大脑（图 1c;拇指螺母每转一整圈对应于 454 μm 的深度穿透）。这种机械瞎想产生了一种组合的光刺激和电子纪录开拓（图 D）。1a） 分量适中（完成时 2 克，植入时 ~2.5 克，包括将装配固定在双桨上的丙烯酸的分量）和空间尺寸（高度，22 毫米）。咱们发现目田移动的成年小鼠 （≥5 周龄） 很容易佩戴植入的装配 （图 1d 和在线方法）。
图1.Optetrode 瞎想。（a） Optetrode 的垂直横截面。该开拓的主体由一个塑料外壳和一个翼形螺钉构成，用两个摩擦谐和的塑料销牢牢地固定到位，机械驱动一个透风螺钉，其中包含四个四极管和多模光纤的保护管被粘合到该螺钉中。螺钉头在光纤的金属套圈光纤连续器端和电子接口板上都涂有环氧树脂，该板将四极线微线连续到 18 针电气连续器。插入的光纤水平横截面，附有四个四极不断。（b） 机械驱动器垂直于 a 中横截面的垂直横截面。透风螺钉的下半部分被减薄，使其仅在一个可能的方进取与塑料外壳的纯正紧密贴合，因此在垂直通晓历程中不会旋转。（c） Optetrode 中使用的机械驱动的三维视图。由于插手销会谢却翼形螺钉的垂直平移，因此逆时针标的动弹会导致透风螺钉向下通晓（红色箭头）。（d） 所示为一只 10 周龄的野生型雄性小鼠，在打针 optetrode 和 2 周后（小鼠手术时为 8 周龄）。（e） 四极不断两个通谈上的动作电位振幅娇傲了五个振幅簇（颜料编码）。来自最大幅度通谈的平均动作电位波形娇傲在每个集群的傍边。未蚁集的峰值不会娇傲。
为了测试 optetrode 装配对澄澈纪录神经行径的效率，咱们起先将该装配植入小鼠 （n = 3） 的内侧前额叶皮层 （mPFC），这些小鼠之前打针了腺关联病毒 （AAV5） 佩戴编码增强型黄色荧光卵白 （EYFP） 的基因。当小鼠施行旷场探索任务时，咱们纪录了来自 16 根微线的信号 （OFT，参见在线方法）。在每个四极管的四根导线中的每一根导线上测量的单个尖峰事件的振幅酿成了振幅值18,19 的簇（图 1e），咱们使用两个模范目的30：L 比和拒绝距离评估了这些簇的质料。L 比小于 0.2 且拒绝距离大于 15 的集群被视为单个单元（参见在线方法;n = 45 个来自 43 个 OFT 实验的单个单元，单个单元 L 比 = 0.03 ± 0.04，拒绝距离 = 47.2 ± 24.1，平均值 ± 模范偏差）。为了评估这些单个单元在 22 分钟 OFT 上的巩固性，咱们检查了 OFT 中前 2 分钟的尖峰振幅与终末 2 分钟的尖峰振幅的分离性。咱们发现，从任务来源和已毕的尖峰簇彼此之间从来莫得很好地分开（最小 L 比 = 0.92，平均 ± 模范偏差 = 4.9 ± 3.7;最大拒绝距离 = 8.2，平均±模范偏差 = 4.0 ± 1.4），这标明驱动器瞎想产生了巩固的纪录。此外，咱们发现该驱动器简略在至少 6 周的期间鸿沟内纪录来自澌灭站点的高质料信号（补充图 1）。
2.2 目田移动小鼠的光学扼制期间的纪录
咱们接下来测试了该开拓在抒发视卵白的澄澈行动小鼠中纪录神经信号的才能。起先，咱们起先筹商了抒发盐视紫红质 eNpHR3.0 的小鼠的阐发，该反应已被讲解在体内纪录期间扼制动作电位15，但尚未在目田移动的哺乳动物中进行检查。咱们将该装配植入小鼠 （n = 2） 体内，该小鼠打针了含有编码 eNpHR3.0-EYFP 和会卵白的基因的 AAV，该 AAV 在东谈主突触卵白启动子 （hSyn） 的限定下，一种平凡抒发的神经元启动子（补充图 2）。将小鼠置于空旷场地中 18 分钟，并显现于 30 秒的照明脉冲（λ = 561 nm，连气儿光，植入光纤顶端的功率密度为 160-260 mW mm-2,0.5 mm 处为 17-26 mW mm-2，纤维下方 1 mm 处为 4-7 mW mm-2 31，32） 被 90 秒的昏黑纪元相隔。咱们发现，平均而言，多单元活性减少了 26.6 ± 6.8%（平均值 ± s.d.，n = 14 个 OFT 的 40 个四极细胞纪录位点，P < 0.001，t 考研; 图 2a）在照明时期。咱们简略在 14 次 OFT 曝光期间分离出 23 个单个单元，况兼在光照期间险些通盘细胞中都存在拒绝（23 个细胞中有 21 个在光照期间赓续倨傲簇质料阈值;在线方法和图 2b）。
2.3 在单独的窗口中绽放
图 2.Optetrode 在 OFT 期间的平凡光遗传学刺激期间促进了电生理学。（A-E）野生型 （WT） 小鼠用 AAV5-hSyn：：eNpHR3.0-EYFP 转导。平均 MUA 以 1 Hz （a） 的速率分箱。暗影区域线路 s.e.m.（n = 30 个四极管纪录站点，14 个 OFT）。绘图了无光刺激和光刺激期间的簇的 L 比值（左）和拒绝距离（右）（n = 23 个簇，b）。栅格图（上图）和相应的归一化放电速率弧线（下）娇傲了被绿光激烈扼制的神经元 （c）、领先被绿光扼制但其行径在刺激时期 （d） 的抓续期间内复原的神经元，以及被绿光激勉的神经元 （e）。（f-k）野生型小鼠用 AAV5-hSyn：：ChR2-EYFP 转导。平均 MUA 在 1 Hz 或 10 Hz 贬责档（n = 40 个四极线纪录位点，10 个 OFT;f， g） 的暗影区域线路 s.e.m.绘图无光刺激和光刺激期间的簇的 L 比值（顶部）和拒绝距离（底部）（n = 21 个簇，h）。娇傲了在 5 Hz（顶部）和 20 Hz（底部）刺激期间保抓高簇质料和与光脉冲联系性的神经元示例 （i）。栅格图（顶部）娇傲了示例 神经元在 5 Hz 和 20 Hz 刺激期间相关于每个光脉冲来源的尖峰期间，以及相应的脉冲触发平均放射速率（底部）。只须被归类为在莫得光刺激的情况下深重拒绝的簇（参见在线方法）才在 b-e 和 h-k 中绘图。水平虚线线路高度拒绝的集群的截止值。
21 个分离的细胞包括活性立即受到扼制的细胞（放电率裁汰 68% ± 15%，平均 ± sd，n = 6 分，21 分 < z -1.3），活性缓慢增强的细胞，可能是由于回路效应的后果（放电率增多 137% ± 56%，平均 ± s.d.，n = 4 分，21 分 > 1.3），以及莫得不雅察到光的统计学明显影响的细胞（P > 0.1，t test） 的在那些受光影响的细胞中，对照明之前、期间和之后的单个神经元放电速率能源学的检查揭示了响应照明的复杂能源学。一些神经元被光激烈地立即扼制（图 2c），一些神经元领先立即被光扼制，但在 30 秒的照明时期复原了活性（图 2d），其他神经元在电路照明下逐渐被激勉（图 2e）。这些发现讲解了 optetrode 在拿获行动小鼠中光遗传学指引的神经行径的复杂变化的后劲，在这种情况下，这些变化是由目田移动的动物中光遗传学扼制的初次纪录指引的，这是一个恒久寻求的想法。
2.4 在目田移动的小鼠的光学激勉历程中进行纪录
接下来，咱们探索了在目田移动的小鼠的一系列刺激参数上将电纪录与光刺激相王人集。在植入 optetrode 之前，咱们再次在 hSyn 启动子的限定下，将小鼠 （n = 2） 打针到含有通谈视紫红质 2 （ChR2）-EYFP 和会卵白的 AAV 的 mPFC 中（补充图 2）。这些小鼠进行了 18 分钟的 OFT，在此期间，30 秒的光学限定时期被 120 秒的无光传递间隔 （n = 10 OFT） 离隔。光学限定的纪元由不同频率的脉冲激光构成（激光波长 λ = 473 nm，脉冲宽度 5 ms，注入光纤顶端的功率密度 60-160 mW mm-2，对应于光纤下方 0.5 mm 处的推测功率密度为 5-12 mW mm-2，在光纤下方 1 mm 处为 1-3 mW mm-2， 在四极管顶端）。在每次 OFT 期间，在以下生理和临床关联的刺激频率上对脉冲频率进行两次扫描：低 （5 Hz）、中 （20 Hz） 和高 （130 Hz;脑深部刺激33-35，DBS）。这些刺激方式泛泛在系统神经科学和临床医学中从传统电极传递，但事实讲解，由于电刺激会引起电伪影，尤其是在较高频率下，很难笃定局部神经对刺激的反应。尽管使用 Ca2+ 成像技巧了解电刺激怨家部固定动物的影响也曾取得了进展36，但光遗传学刺激使咱们简略幸免电伪影并同期纪录局部神经行径。
即使在 130 Hz 下，咱们也简略不雅察到多单元神经对光刺激的反应（图 2f）。多单元行径（MUA，参见在线方法）通过 20 Hz 刺激（增多 115.7 ± 18.6%，平均 ± s.d.，n = 40 个 tetrode 纪录位点，10 个 OFTs，P < 0.0001）和 130 Hz 刺激（37.1 ± 11.7%，平均 ± s.d.，P < 0.005）显赫增多，并来源在 5 Hz 刺激下回荡（MUA 以更邃密的分辨率分档;图 2g）。在 130 Hz 刺激的第一秒内，MUA 出现急剧尖峰，随后下落到延迟、激勉较少的阶段（图 2g）。这个延迟期泛泛受到扼制并抓续进取刺激期，这一发当今解释 DBS 机制方面具有卓绝大的临床意思意思（补充图 3）。在刺激历程中也不错分离一些单个单元，但在 ChR2 促进的光刺激期间增多的多单元配景和尖峰振幅的变化使得很多单元的拒绝变得繁重。这反馈在刺激期间簇质料目的的裁汰（图 2h）。尽管如斯，很多单元在刺激期间仍然保抓深重拒绝（21 个单元中的 9 个，10 个 OFT;图 2i-k 和补充图 4）。
在 ChR2 介导的刺激历程中，充分分离的单个单元数目减少的一种可能解释是 ChR2 基因是由平凡抒发的 hSyn 启动子37 驱动的。通过在更特定的神经元群中抒发 ChR2 的小鼠中测试 optetrode（也与光遗传学泛泛与 optetrode 王人集使用的样式更一致），咱们假定咱们不错晋升光刺激期间的簇质料。咱们将 optetrode 驱动器植入另外两类小鼠中：在更特异性启动子 （CaMKIIα） 下抒发 ChR2 的小鼠和在抒发微小白卵白的神经元中以重组酶依赖性靶向样式抒发 ChR2 的小鼠（PV：：Cre 转基因系）;在这两种情况下，咱们都像之前的实验一样将 AAV5 打针到 mPFC 中（补充图 5 和 6）。
咱们使用与 hSyn 小鼠换取的实验有筹备，将打针 AAV5-CaMKIIα：：ChR2-EYFP 的小鼠打针到 mPFC （n = 2） 中进行 22 分钟的 OFT，但使用 2 毫秒脉冲宽度而不是 5 毫秒的额外 130 Hz 刺激时期。这个额外的 epoch 旨在减少高频刺激的占空比，该枢纽与临床 DBS 更关联。咱们还迅速化了各类刺激频率的规章（激光波长 λ = 473 nm，植入光纤顶端的功率密度 = 96 mW mm-2，对应于 0.5 mm 处的推测功率密度为 9 mW mm-2 和纤维下方 2 mm 处 2 mW mm-2，在四极管顶端）。相似，咱们不雅察到在 20 Hz 刺激期间 MUA 增多（增多 173%，n = 84 个 OFT 中的 33 个四极线纪录位点;图 3a）和 5 Hz 刺激期间的回荡 MUA（图 3b）。咱们发现 CaMKIIα：：EYFP 在职何刺激频率下 MUA 均无显赫变化 （P > 0.2）。关联词，与 hSyn 启动子比拟，在 CaMKIIα 启动子的限定下，抒发 ChR2 的小鼠的 130 Hz 反应在驱动峰值后并未裁汰至基线（图 3a）。在光刺激期间，安详神经元的聚类质料发生了变化（14 个单元中有 7 个保抓安详，n = 33 OFT;图 3c），但在保抓拒绝的细胞中不错不雅察到对单个光脉冲的激烈响应（举例，潜藏期 = 4.9 ± 0.3 毫秒，平均值 ± 模范偏差;Fig. 3d–f） 的
图 3.在 OFT 的配景下，Optetrode 促进了细胞类型特异性光遗传学刺激期间的电生理学。（a-f）野生型小鼠用 AAV5-CaMKIIα：：ChR2-EYFP 转导。平均 MUA 以 1 Hz （a） 和 10 Hz （b） 的速率分箱。暗影区域线路 s.e.m.（n = 84 个四极管纪录站点，33 个 OFT）。绘图了莫得光刺激和光刺激期间的簇的 L 比值（顶部）和拒绝距离（底部）（n = 14 个簇，c）。娇傲了一个示例神经元，它在 5 Hz（左）和 20 Hz（右）光刺激 （d） 期间保抓了高簇质料和与光脉冲的联系性。尖峰期间（左）和脉冲触发的平均放射速率（右）的光栅图娇傲了一个示例神经元在 5 Hz （e） 和 20 Hz （f） 刺激期间相关于每个光脉冲来源的栅格图。（g-k）用 AAV5–DIO-EF1α：：ChR2-EYFP 转导 PV：：Cre 转基因小鼠。平均 MUA 以 1 Hz （g） 分档。暗影区域线路 s.e.m.（n = 45 个四极线纪录站点，29 个 OFT）。在莫得光刺激和光刺激期间绘图 L 比值（左）和拒绝距离（右）（n = 50 个簇，h）。一个例子娇傲，神经元在响应 5 Hz（左）和 20 Hz（右）刺激抒发小白卵白的细胞 （i） 时保抓高簇质料和裁汰的放电率。娇傲了示例 神经元在 5 Hz （j） 和 20 Hz （k） 刺激期间相关于每个光脉冲来源的尖峰期间（左）和脉冲触发平均放射速率（右）的光栅图。只须被归类为在莫得光刺激的情况下深重拒绝的簇（参见在线方法）才被绘图在 c-f 和 h-k 中。水平虚线线路全都拒绝的集群的截止值。
为了进一步探索 optetrode 在 ChR2 驱动的光学激勉历程均分离单个神经元的才能，咱们探讨了刺激扼制性中间神经元（即抒发小白卵白的细胞）的寥落神经元群的影响。咱们再次在 mPFC 中植入 optetrodes;关联词，咱们莫得使用野生型小鼠，而是在 EF1α 启动子13,14 的限定下，向 PV：：Cre 小鼠 （n = 2）38 打针了佩戴 loxP 侧翼 ChR2-EYFP 和会构建体 （DIO） 的 AAV5。DIO 构建体允许想法卵白仅在抒发 Cre 重组酶的细胞中抒发（补充图 6）。咱们对小鼠进行了与抒发 CaMKIIα：：ChR2 的小鼠换取的 OFT 有筹备，并纪录了局部 MUA （图 3g） 和单单元活性。在这种情况下，保抓高簇质料的才能险些不受光刺激的影响（图 3h），允许在光刺激期间不雅察到险些通盘被分离的单个单元（n = 29 个 OFT 中 50 个单个单元中的 46 个;图 3h，参见在线方法）。值得留心的是，在这种情况下，咱们不雅察到这些小鼠在光刺激期间对平均 MUA 险些莫得影响（图 3g），但单个单元（图 3i）对单个光脉冲阐发出激烈的反应，举例瞬态扼制（图 3j、k 和补充图 7）。这些单元在响应光时都莫得阐发出低抖动动作电位，标明它们不是抒发 ChR2 的小白卵白阳性神经元。相背，卓绝多的单元对光阐发出平凡和延迟的扼制 （P < 0.0005，二项式考研;46 个神经元中有 9 个娇傲放电率裁汰，P < 0.05，Bonferroni 更正 t 考研;图 3j、k），正如顺利召募小白卵白阳性14 神经元行径的突触或多突触效应所预期的那样。事实上，在小白卵白阳性 EYFP 对照小鼠中纪录的神经元莫得娇傲出响应光的放电速率变化 （n = 3 只小鼠，29 个神经元中的 0 只，迪士尼彩乐园3总代P > 0.05;在线方法）。
2.5 光学激勉期间的鼠标行动
optetrode 驱动器瞎想的一个要害特质是它保抓实足小和轻，可用于目田行动的小鼠。咱们简略同期探索 mPFC 中的光刺激对 OFT 中神经行径和行动的影响。咱们分析了 22 分钟 OFT 期间行动的两个方面：小鼠速率和小鼠占据笼子中心的期间段，这是对惊恐关联行动的经过考据的测量39。咱们规划了每个 OFT 的第一个光刺激时期之前以及不同频率和脉宽刺激时期期间和之后的平均速率。值得留心的是，咱们发当今昂扬性神经元 （CaMKIIα：：ChR2） 中抒发 ChR2 的小鼠在 20 Hz 和 130 Hz 刺激期间阐发出速率增多（P < 0.0001 关于 20 和 130 Hz，5 毫秒脉宽刺激;P < 0.02 关于 130 Hz，2 毫秒脉宽;Bonferroni 更正 t 考研;图 4a）因此在刺激期间具有更长的旅途长度（图 4b），但在 5 Hz 刺激期间莫得发生这种增多。这种方式与产生 MUA 增多的刺激频率一致（图 4c）。另一方面，EYFP 无视卵白对照对平均 MUA 或速率莫得阐发出任何光的影响。畴昔的筹商16,40 不雅察到皮层光学刺激的通晓变化，但至关进犯的是，在不雅察到的行动效应期间无法提供关联局部神经元行径的信息;使用 Optetrode，您不错赢得此信息。
图 4.OFT 期间光遗传学刺激的行动和神经行径影响。小鼠秉承 22 分钟的 OFT 并每 2 分钟显现于 30 秒的光刺激时期。咱们使用 5 Hz、20 Hz、130 Hz 和 5 ms 脉冲宽度和 130 Hz 2 ms 脉冲宽度作为刺激参数。每种刺激类型赶巧使用了两次，况兼规章是迅速的。（a） CaMKIIα：：ChR2-EYFP （n = 2 只小鼠 33 个 OFTs 的 84 个四旋线纪录位点）和 CaMKIIα：：EYFP 小鼠 （n = 3 只小鼠 43 个 OFTs 的 119 个四极线纪录位点） 在每个刺激时期和之后在 mPFC 中。*P < 0.05，***P < 0.001。（b） 示例 OFT 轨迹娇傲小鼠在刺激前 30 秒内（上）和 20 Hz 刺激 30 秒内（下）的旅途。（c， d）数据线路为归一化平均多单元射击率 （c） 和在旷地中心破耗的期间百分比 （d）。通盘罪过线均线路 s.e.m.
为了量化在旷场中心破耗的期间，咱们规划了鼠标距离旷场框最近一侧进取 10 cm 的每个纪元的分数。咱们发现，与 CaMKIIα：：EYFP 对照小鼠比拟，光刺激枢纽对 CaMKIIα：：ChR2 小鼠在旷场中心停留的期间莫得平均影响 （P > 0.1;图 4d），尽管两种类型的小鼠在领先的 2 分钟刺激前阶段在中心破耗的期间都比随后的时期少，这标明它们当然地适应了磁场（P < 0.05;图 4d）。咱们对在小白卵白阳性细胞中抒发 ChR2 的小鼠进行了换取的分析，咱们莫得不雅察到光刺激对动物速率、在中心停留的期间或纪录的 MUA 的平均影响（补充图 8）。
2.6 在目田移动的小鼠中纪录界说的神经投射
Optetrode 方法无须局限于纪录含有抒发视卵白的细胞体的区域的行径，而且原则上不错彭胀到从招揽来私用视卵白转导的汉典大脑区域的投射的细胞进行纪录。在终末一组实验中，咱们测试了 optetrode 在大脑区域之间驱动特定神经投射并评估这些投射对目田移动的小鼠的功能影响的才能。咱们在 CaMKIIα 启动子的限定下将编码 ChR2-EYFP 的 AAV5 打针到基底外侧杏仁核 （BLA） 中，但莫得将 Optetrode 植入 BLA，而是将 Optetrode 抛弃在前面际 （PrL） 新皮层上方。在这种情况下，不错纪录 PrL 神经元的行径，同期刺激从 BLA 投射到 mPFC41，其中 PrL 是其中的一部分（图 5a）。这种投影靶向战术关于能很好地运输到轴突6、15、16 的视卵白是可行的。
图 5.Optetrode 投影靶向：将轴突输入从 BLA 驱动到 mPFC。（a） 娇傲 BLA 到 mPFC 投影想法的暗示图。（b） PrL 神经元的自愿行径娇傲在 1 秒的期间窗口内。（c） 在 b 中娇傲了纪录的平均动作电位局面。暗影区域线路平均值的 s.e.m.。（d） 对 b 中单元的放射速率进行自关联分析，娇傲在 ≤1 s. a.u. 的模范上，纵情单元的放射方式莫得较着的周期性。（e） BLA 到 mPFC 投影的光刺激在 b 中诱发了该单元的动作电位以及复杂的多单元反应（数据未娇傲）。（f） 以 e 线路纪录的平均动作电位局面。（g） 自关联分析娇傲，该装配在目田移动的旷场勘察期间以 10 Hz 的周期性放射，与施加的光学刺激联系。在注入光纤顶端遴荐激光 λ = 473 nm，脉冲宽度为 5 ms，速率为 10 Hz，功率密度为 80 mW mm-2（在光纤下方 0.5 mm 处为 6 mW mm-2，在光纤下方 1 mm 处为 1 mW mm-2，在四极管顶端处）。
老伴早几年去世了，老太太过的日子特别困难。屋子里没有暖气，非常冷，夜里碗里的水都能结冻。
PrL 单元的配景活性（图 5b、c）娇傲其放射方式中莫得潜在的周期性（图 5d）。关联词，当使用蓝光 （λ = 473 nm） 的 10 Hz 刺激将 BLA 投影驱动到 mPFC 中时，安详单元娇傲出期间方式的显赫变化（图 5e），保抓换取的尖峰波形（图 5f）。在光学投影刺激期间该单元的纪录的自关联娇傲 0.1 秒的周期性，与 10 Hz 刺激一致（图 5g）。除了单个单元与激光脉冲的同步外，刺激还产生了复杂的多单元响应，这些响应在这些目田行动的小鼠中不雅察到的单元（数据未娇傲）同步触发之前（但不影响拒绝）。
三、议论
将光遗传学限定的精度与单单元神经能源学的电生理读数相王人集，关于寻求修复因果关系和加深对神经回路能源学的瓦解的行动实验至关进犯。咱们开发了一种 optrode 装配 optetrode，它允许在澄澈的目田移动小鼠中同期进行光学究诘和 tetrode 电生理学。Optetrode 的一个要害特质是其以光纤为中心的瞎想，允许使用单螺杆驱动在 4 mm 的脑深鸿沟内传播光纤和四极管（图 1a-c）。这种机械驱动瞎想减小了开拓的尺寸和分量，并允许目田移动的鼠标陶然地佩戴它。咱们和其他东谈主最近在行动小鼠中讲解了光遗传学限定和多单元纪录的42,43 整合，但穷乏通过澌灭动物的多个大脑区域以固定且可量度的空间关系将光源和纪录电极共同鼓动的才能;事实上，Optetrode 中的光纤还不错兼作四极管的结构因循，从而简略准确、正经地靶向深部大脑结构。此外，Optetrode 以低资本将目田移动的小鼠电生理学与光遗传学相王人集，况兼制造枢纽阳春白雪，不需要特殊的设施。
咱们通过初次量化目田移动小鼠中光学扼制或激勉特定局部 mPFC 细胞的生理效应来考据 optetrode。从 halorhodopsin 的作用机制来看，通过 eNpHR3.0 激活不雅察到的对神经行径的激烈扼制（图 2a）是预期的。关联词，Optetrode 在光刺激期间纪录单个神经元行径的才能（图 2b）揭示了局部汇集合反应的各类性（图 2c-e）。被光立即和抓续扼制的神经元（图 2c）很可能抒发 eNpHR3.0，况兼它们的放电反应由 eNpHR3.0 介导的氯离子电流主导。比拟之下，在照明期间阐发出较高放电速率的神经元（图 2e）可能招揽到来自扼制性神经元的输入，这些神经元泛泛会扼制其行径，但会受到光的扼制。因此，这些神经元的放电能源学仅波折受到 eNpHR3.0 对光的反应的影响。相似，很多单元在照明下放射速率的驱动快速 （<100 ms） 裁汰 （图 2d） 可能是 eNpHR3.0 抒发和功能的后果，然则，与 eNpHR3.0 能源学不匹配的后续能源学可能受汇集行径的限定。值得留心的是，咱们发现被扼制的神经元阐发出相配快的扼制起病期间，这与已知的快速泵送机制一致。这一发现支抓这些哺乳动物制剂中光遗传学扼制的平直和细胞内在方式。与光遗传学激勉一样，在光遗传学操作历程中，若是莫得同期多通谈读数，将很难在目田移动的小鼠中识别这些特质。
正如预期的那样，在 ChR2 促进的脉冲蓝光激勉期间单个神经元的分辨率取决于光敏细胞的密度。在使用 hSyn 或 CaMKIIα 启动子驱动 mPFC 抒发而产生的 ChR2 抒发细胞的密集群体中，对脉冲刺激的一致群体反应泛泛会压倒单个单元的反应（图 2h 和 and3c）。关联词，很多单元仍然保抓了高簇质料，同期阐发出与刺激脉冲的高度联系性（图 2i-k 和 3d-f）。比拟之下，在对包含密度裁汰的 ChR2 抒发细胞的局部汇集进行光刺激时，簇质料和分离单个单元的才能不受影响，就像抒发小白卵白的神经元一样（图 3i），这是光遗传学实验的典型配置。在这种配置下，optetrode 比电刺激期间的纪录具有较着的上风，电伪影罢休了分辨率，况兼不行能进行细胞类型特异性刺激。
咱们在 30 秒刺激时期对 130 Hz 刺激的电生理反应的动态变化（图 2f、g 和 3a、b 和补充图 7）的不雅察不仅晋升了咱们对使用这些频率的 DBS 战术的瓦解（尽管进犯的是要留心 DBS 电极可能召募与光遗传学刺激不同的轴突和细胞体方式）， 但也强调了电生理纪录在光遗传学行动实验中的进犯性，因为由于电伪影，在使用电 DBS 时尤其难以贬责对局部电路的影响。除了在局部胞体的光遗传学刺激历程中提供对汇集行径的视力外，optetrode 还可用于提供受特定投射刺激影响的神经行径的读数（图 5）。终末，由于其适中的分量和占大地积（植入部位为 0.12 mm2，颅骨名义为 8 mm2），optetrode 不错与其他刺激源（如光纤）或额外的纪录电极相王人集，为日益丰富的神经回路究诘器用箱作念出孝敬。
由于 optetrode 不错很容易地以低资本（x3C$100）制造，无需特殊的开拓和最少的培训（补充诠释和补充图 9），况兼在行动实验期间提供高质料的电生理纪录，因此用 optetrode 植入的动物成例补充转导的动物部队变得很肤浅，这些动物可用于在光遗传学驱动行动期间监测单元。这种方法将促进行动数据的分析，减少与不雅察到的（而不是假定的）局部单元行径一致的解释数目，从而最大限制地减幼年鼠行动分析中的偏见和鷽鸠笑鹏。通过提供与光遗传学的速率和特异性兼容的快速多通谈读数，Optetrode 向进一步开发系统神经科学的精准和因果电路究诘迈出了一步。
3.1 Optetrode 制造
咱们将 16 根团聚物涂层的 NiCr 微线连续到电极接口板和金针并将它们缠绕成四个四极不断。然后将这些束穿过保护性塑料管（16 毫米长，0.02 英寸内径，0.002 英寸壁厚;小零件），用 Loctite 环氧树脂连续到 EIB。机械传动装配的塑料外壳是在 SolidWorks 2007中瞎想的，并在里面加工。不锈钢拇指螺母通过两个塑料插手销固定在外壳上。不锈钢透风螺钉的下半部分从两侧减薄，产生 0.0625 英寸× 0.086 英寸的横截面（原始螺钉直径为 0.086 英寸），这导致过盈谐和（摩擦谐和）到塑料外壳的导向通谈（0.23 英寸长，0.063 英寸× 0.09 英寸横截面）。然后将透风螺钉拧入拇指螺母中，并通过逆时针动弹拇指螺母来裁汰，使螺钉的薄部分位于导向通谈中，从而守护螺钉在前进历程中旋转。然后将带有连续管和四极不断的 EIB 与机械驱动器拼装在通盘，使 EIB 与透风的螺帽王人平，况兼包含四极管的保护管位于螺杆的透风口内。一个光纤插芯（200 μm 硅芯光纤，不锈钢插芯，5 mm 高，2.5 或 1.直径为 25 mm，多立克透镜）然后添加到组件中，以便光纤与四极不断分享保护塑料管的里面，并将套圈配置在 EIB 的顶部以便于访谒。光纤套圈和 EIB 用 Loctite 环氧树脂连续到透风螺钉上。将四极管切割成所需的长度（在光纤下方蔓延 ~0.5 mm）。胶体金通过电化学千里积到微线的职责端（驱动电流 ~50 mA）。此历程将微线的阻抗从 3-10 MΩ 裁汰到 150-350 kΩ（职责阻抗）。然后，EIB 的顶部障翳有 Loctite 环氧树脂保护层，以保护脆弱的微线在手术和动物行动历程中免受潜在损坏（参见补充诠释）。
3.2 科目
通盘实验均字据斯坦福机构动物照管和使用委员会批准的有筹备进行，并遴选一切防卫设施以尽量减少压力和所用动物的数目。咱们使用了病毒打针时 8 周龄的雄性小鼠。
3.3 病毒打针和 optetrode 植脱手术
执政生型小鼠的 hSyn 或 CaMKIIα 启动子的限定下，使用 AAV5 将 ChR2-EYFP 和 eNpHR3.0-EYFP 的遗传物资寄递到小鼠神经元，或使用带有 EF1α 启动子的 DIO 构建体13 在 PV：：Cre （S. Arber， University of Basel） 转基因小鼠中。AAV5 病毒由北卡罗来纳大学教堂山分校 （University of North Carolina） 教堂山分校 （University of North Carolina） 教堂山分校 （University of North Carolina） 的 Vector Core 出产，滴度为 3.0 × 1012 cfu ml-1。通盘小鼠均通过腹膜内打针氯胺酮-甲苯噻嗪搀杂物麻醉，然后放入立体定向框架 （David Kopf Instruments）;然后提供低剂量的异氟醚以在手术历程中保抓深度麻醉景色。将病毒从三个深度（距前囟 1.6-1.8 mm、2.4-2.5 mm 和 3-3.3 mm）打针到 mPFC 中。每个打针部位的总病毒体积为 300 nl，打针速率为 150 nl min-1。然后将 Optetrode 放入开颅手术中，直到四极管到达距离前囟 1.2-1.6 mm 的深度。在使用 Metabond （Parkell） 将 optetrode 长久附着到颅骨上之前，四极管用凡士林层和 Kwik-Kast 有机硅弹性体保护。植入后，用 Vetbond 粘合剂 （3M） 将 optetrode 周围的皮肤粘合在通盘;皮下打针 Buprenex （0.05 mg/kg 体重） 和 Carprofen （5 mg/kg） 用于复原期间的难堪胁制。
3.4 免疫组化和影像学检查
小鼠用 Beuthanasia-D麻醉，并在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （pH 7.4） 顶用冰冷的 4% 多聚甲醛 （wt/vol） 精心灌输。将大脑在 4% 多聚甲醛中固定过夜，并在 PBS 中的 30% 蔗糖 （wt/vol） 中均衡。咱们在冷冻切片机（徕卡）上切下 40 μm 冠状切片，并将它们储存在 4°C 的冷冻保护剂（25% 甘油（体积/体积），30% 乙二醇（体积/体积），在 PBS 中），直到咱们处理它们进行免疫组织化学。将目田漂流的切片在 PBS 中洗涤，然后在 0.1% Triton X-100 （vol/vol） 和 3% 正常驴血清 （vol/vol） 中孵育 30 分钟。将切片与 3% 正常驴血清中的一抗（小鼠 CaMKIIα 抗体，1：500，Abcam;兔小清卵白抗体，1：500，Abcam;兔抗 GABA 抗体，1：500）。然后用PBS洗涤切片，并在20°C下与二抗（与Cy3或Cy5偶联的驴抗体，以及与Cy3或Cy5偶联的兔驴抗体，均以1：1,000）孵育3小时。然后用 PBS 洗涤切片，用 DAPI （1：50,000） 孵育 20 分钟，再次用 PBS 洗涤，并用 PVA-Dabco封固在载玻片上。在扫描激皎洁微镜 （Leica SP5） 上使用 40×、1.25 NA 油浸物镜蚁集共聚焦荧光图像。图像不受数字对比度或亮度革新的影响。
一组 5 只小鼠（2 只 CaMKIIα：：ChR2、1 只 CaMKIIα：：EYFP 和 2 只 PV：：Cre）显现于八个 100 mW mm-2 蓝光刺激时期（每个 30 秒）和 5 ms 脉冲宽度的蓝光下，对可能的不详组织毁伤进行了处理;大脑被固定、切片、DAPI 染色并仔细检查。尽管这种蓝光处理（若是有的话）比图中提供光遗传学刺激的情况更严重，但咱们仍然莫得不雅察到纤维下方或周边组织中组织质料（变形、DAPI染色或着色更变、细胞数目、核大小或局面变化）的互异。关联词，这是在通盘光遗传学实验历程中需要追踪和检查的进犯参数。
3.5 数据蚁集和分析
通盘电生理纪录均使用 Digital Lynx 10S-Z800 集成硬件和软件系统 在澄澈、目田移动的动物中进行。电信号经过过滤 （600–6,000 Hz） 并使用 HS-18-CNR-LED 头级放大器进行放大。使用神经数据蚁集软件中集成的 LED 追踪系统追踪 40 × 40 厘米浅灰色原野内的鼠标位置。纤维和四极管在实验前至少 30 分钟通过机械驱动器传播到纪录点（泛泛抛弃过夜），以确保巩固的纪录。通过通过氧化锆套管 （Doric Lenses） 连续到光学套管 （Doric Lenses） 的光纤套圈的套圈端接植入式光纤 （Doric Lenses） 进行光刺激。为了对抒发 ChR2 的小鼠的 mPFC 进行光学刺激，咱们使用了蓝色二极管泵浦固体激光器（λ = 473 nm，OEM 激光器），脉冲频率为 5 Hz、20 Hz 或 130 Hz，脉冲宽度为 5 ms（或在某些情况下为 130 Hz，脉冲宽度为 2 ms），光纤顶端的功率密度为 60-160 mW mm-2（功率输出是通过非植入式光纤插芯测量的，该光纤插芯与用于 Optetrode 的阿谁）。从光纤顶端不同距离处的光功率被推测为波长和光纤顶端光功率的函数（参考文件 30 的规划已针对波出息行更正）。
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关于在 hSyn 启动子下抒发 ChR2 的小鼠，OFT 期间的刺激包括每 2 分钟来源的 30 秒刺激时期。epochs 期间的刺激频率使用 5 ms 脉冲宽度通过 5 Hz、20 Hz 或 130 Hz 刺激序列轮回两次。在 CaMKIIα 启动子限定下抒发 ChR2 的小鼠和在抒发小白卵白的神经元中抒发 ChR2 的小鼠，以及仅抒发 EYFP 的对照小鼠中，刺激频率的规章被成列以限定序列特异性效应。在 OFT 历程中，每种刺激类型都恰好欺诈了两次。为了对抒发 eNpHR3.0 的小鼠的 mPFC 进行光学刺激，咱们使用了连气儿波方式的绿色二极管泵浦固态激光器（λ = 561 nm，CrystaLaser），功率密度为 160-260 mW mm-2 在光纤顶端。30 秒刺激时期与 90 秒的休息时期分开，并在实验历程中叠加 7-8 次。
使用 OfflineSorter 2.8.9.0 （Plexon） 手动对神经数据进行排序，并在 MATLAB中进行分析。针对 Digital Lynx 检测到的每个尖峰事件，索求四个四极管通谈上的最大和最小电压。尖峰事件蚁集在这个八维特征空间中。与噪声簇（最围聚原点的尖峰簇）不同的尖峰簇是在一个或多个二维投影中使用多边形界说的。集群被界说为对尖峰区间 （ISI） 散播不行见。只须包含 <0.01% 的 ISI < 1 ms 尖峰的集群才被磋商作为单个单元的候选者进行进一步检查。然后使用两个定量目的评估每个集群的质料：L 比值和拒绝距离30。
这些测度规划簇中的尖峰与澌灭四极管上纪录的其他尖峰的分离进程。L 比率将聚类视为多变量高斯散播，并线路非聚类尖峰来自该高斯散播的平均概率。劝诫标明，它罕见能指令 II 类诞妄或遗漏尖峰的数目。拒绝距离推测了簇尖峰与澌灭四极管上纪录的其他尖峰的距离，并已被讲解标明 I 类诞妄或耻辱尖峰的数目。当集群中的峰值多于集群中的峰值时，拒绝距离是不笃定的。在这些漠视的情况下，仅使用 L 比值来评估集群质料。在八维特征空间中 L 比小于 0.2 且拒绝距离大于 15 的集群被觉得是推定的单个单元。由于集群质料目的仅在使用换取数目的维度进行规划时具有可比性，因此扼杀了一个或多个电极断开的四极管。集群也作为期间的函数进行了检查。在高频刺激期间，不错不雅察到一些簇平滑地向较低振幅的尖峰移动。在这些情况下，若是该群集仍可与其他尖峰区别开来，则将多边形界说为包含涂抹的群集。在图 3h 中，两个神经元在光刺激期间莫得尖峰，因此具有未界说的簇质料评分。这些神经元在光刺激期间莫得被动作分离深重。
关于某些分析，使用了多单元放射速率。规划每个四极管的多单元放射速率为图 2af 的 1 秒区间中通盘阈值交叉的速率，图 2g 和 3b、3b 的 3a、g、100 毫秒区间中的通盘阈值交叉率，以及图 4 的系数纪元。多单元放射速率取零丁纪录数目（OFT 实验的数目乘以实验期间纪录电压阈值交叉的四极管数目）的平均值。图 2a、f 和 3a、b 中的暗影区域以及图 4c 中的条形娇傲了这些描述集成平均 MUA 的平均值的模范罪过。
关于抒发 eNpHR3.0 的小鼠的数据分析，若是神经元在光刺激期间的放电速率的 z 分数相关于配景放电速率为 <−1.3，则将其归类为扼制神经元（图 2c-e）;z 评分> 1.3 的神经元被归类为增强神经元（图 2e）。为了规划 z 分数，咱们将预刺激时期和光刺激时期的放电率分红 10 秒的区间，并比较速率的后果散播。
为了评估蓝光 （λ = 473 nm） 刺激对在小白卵白阳性神经元（和 EYFP 对照）中抒发 ChR2 的小鼠神经元放电率的影响，咱们比较了光脉冲前 20 毫秒的平均放电与 20 Hz 刺激期间光脉冲后 10 毫秒的平均放电。使用非参数自助评估每个神经元放电速率变化的显赫性：使用迅速脉冲期间进行 1,000 次模拟。
在 MATLAB 中对位置数据进行统计分析。豁达场地的中心被界说为距离通盘四面墙大于 10 厘米。位置用 0.6 s 箱式滤波器平滑以去除噪声。使用随后 25 个视频帧 （~0.84 s） 中行进的距离推测每个期间点的速率。在图 4 中，P 值是通过 Bonferroni 更正的双尾学生 t 考研规划的。
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